彭琬昕万燕雅葛璐金洁龚爱华吴朝阳 江苏大学医学院生物系、江苏大学附属人民医院肿瘤放疗科 摘要： 本实验将胰腺癌细胞PaTu8988分别转染无关干扰对照组（siRNA-Scramble）和干扰即刻早期基因Egr-1组（siRNA-Egr-1），再用不同浓度的汉防己甲素处理24h后，CCK-8法检测不同浓度的汉防己甲素对细胞活力的影响：Westernblot检测细胞自噬和凋亡相关蛋白表达水平的改变。 结果表明：（1）低浓度的汉防己甲素能显著激活PaTu8988细胞自噬，但对增殖和凋亡无明显影响；（2）与对照组相比，转染了siRNA-Egr-1组自噬相关蛋白Be⁃clin-1表达量显著下降，LC3II/LC3I比值下调；凋亡相关蛋白Bcl2/Bax的比值降低。上述结果表明，干扰即刻早期基因Egr-1的表达可以有效抑制低浓度汉防己甲素引起的胰腺癌细胞PaTu8988自噬，促进细胞凋亡。 关键词：胰腺癌，汉防己甲素，Egr-1，细胞自噬，细胞凋亡 胰腺癌是恶性程度极高的消化道肿瘤。近年来，我国胰腺癌发病率呈现上升趋势，居肿瘤死因前10位。大多数患者在确诊时肿瘤已发生转移，失去根治性手术切除时机，5年生存率低，预后极差。 汉防己甲素（tetrandrine，Tet）是从防己科植物粉防己的块根中提取的一种双节基异喳琳类生物碱，具有非常广泛的药理效用，临床上常用来治疗高血压、肺纤维化、矽肺等疾病。近年来发现，汉防己甲素在肿瘤治疗方面也具有很好活性，可以逆转多药耐受，较高浓度的汉防己甲素可诱导肺癌、肝癌、淋巴癌细胞凋亡，而较低浓度的汉防己甲素对肿瘤细胞存活并无影响。近年来有研究报道，低浓度的汉防己甲素可能通过激活细胞自噬引起对肿瘤细胞的保护作用，抑制凋亡。 我们前期的研究发现即刻早期因子Egr-1对低氧诱导的细胞自噬有明显的促进作用，并可引起肝癌细胞化疗耐受。本研究通过特异性siRNA干扰Egr-1表达，探讨干扰Egr-1对低浓度汉防己甲素引起的胰腺癌细胞PaTu8988自噬、凋亡的影响。 1.1 材料 人胰腺癌细胞株PaTu8988购自美国ATCC；汉防己甲素购自Sigma（T2695）公司；CCK-8购自Promega公司；二甲基亚砜（DMSO）购自Amresco公司；鼠抗人α微管蛋白抗体购自Bioworld；鼠抗人Bcl-2、Bax抗体购自SantaCruz公司；HRP标记的抗鼠和抗兔的二抗购自上海康成公司。DMEM，胎牛血清及脂质体Lipo⁃fectamine2000转染试剂均购自Invitrogen公司。 主要仪器 SW-CJ-1CU型双人单面净化工作台购自苏州净化设备有限公司；Western-blot电泳仪、电泳槽、转膜仪、酶标仪购自伯乐公司。 1.2 实验方法 人胰腺癌细胞PaTu8988用含10%胎牛血清的DMEM培养液，置 取对数生长期的细胞严格按照试剂说明书操作，采用脂质体Lipofectamine2000转染试剂将Scramble-siRNA（ PaTu8988细胞转染siScramble和siEgr-124h后，以4×104个/ml密度接种于96孔板（100μl/孔），分别加入不同浓度的汉防己甲素（1μg/mL，2μg/mL，2.5μg/mL，5μg/mL），以含0.1%DMSO的培养液为对照组，每种处理设6个复孔，处理24h后，每孔加入20μLCCK-8继续孵育2h，终止培养，在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光度（OD）值。 RIPA裂解液冰浴裂解不同处理组细胞，收集总蛋白。取50μg总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，湿转法转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉在室温下封闭1h，TBST洗涤1次后加入一抗（Bcl-2、Bax以1∶500稀释，α-tubulin以1∶2000稀释）， 所有实验结果重复3次，用SPSS17。0软件进行统计学分析，并采用单因素方差分析数据，P＜0.05为差异具有统计学意义。 2 结果与分析 2.1 不同浓度的汉防己甲素对胰腺癌细胞PaTu8988增殖能力的影响 选取不同浓度的汉防己甲素（1μg/mL，4μg/mL，8μg/mL，20μg/mL）处理PaTu8988细胞24h，CCK-8检测细胞增殖情况。如图所示（图1），汉防己甲素对PaTu8988细胞增殖抑制呈明显的浓度依赖，低浓度的汉防己甲素对PaTu8988细胞增殖抑制作用不明显（p>0。05）。
2.2 不同浓度的汉防己甲素对胰腺癌细胞PaTu8988自噬、凋亡的影响 选取不同浓度的汉防己甲素（1μg/mL，4μg/mL，8μg/mL）处理PaTu8988细胞24h，Westernblot检测自噬相关蛋白的表达情况。与DMSO对照组相比，汉防己甲素能明显上调自噬关键蛋白Beclin-1的表达量，增加LC3II/LC3I的比值，并且呈现浓度依赖性；而凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达量并没有变化（图2），与上述结果一致。
2.3 Westernblot检测siEgr-1的干扰效果 PaTu8988细胞转染siScramble和siEgr-148h后，裂解细胞，Westernblot检测Egr-1蛋白表达水平的变化。结果显示（图3），与无关干扰对照组相比，干扰了Egr-1组细胞内的Egr-1表达水平明显降低，说明特异性Egr-1-siRNA能有效抑制PaTu8988细胞Egr-1的表达。
2.4 干扰Egr-1对汉防己甲素引起的PaTu8988细胞增殖抑制的促进作用 PaTu8988细胞转染siScramble和siEgr-124h后，按4000/孔接种于96孔板，根据上述实验结果，选取8μg/mL汉防己甲素处理细胞，24h后，CCK-8检测细胞存活率。结果显示（图4），与对照组相比，干扰Egr-1能显著提高汉防己甲素对PaTu8988细胞的增殖抑制作用，提高汉防己甲素的抗肿瘤效果。
2.5 干扰Egr-1抑制汉防己甲素引起的PaTu8988细胞自噬 PaTu8988细胞转染siScramble和siEgr-124h后，8μg/mL汉防己甲素处理细胞，24h后，裂解细胞，Westernblot检测自噬相关蛋白表达水平的变化。结果表明，与转染siScramble的对照组相比，转染siEgr-1组能显著减低汉防己甲素引起的Beclin-1表达的上调，降低LC3II/LC3I的比值，显著抑制细胞自噬。
2.6 干扰Egr-1促进汉防己甲素引起的PaTu8988细胞凋亡 PaTu8988细胞转染siScramble和siEgr-1
24h后，8μg/mL汉防己甲素处理细胞，24h后，裂解细胞，Westernblot检测凋亡相关蛋白表达水平的变化。结果表明，与转染siScramble的对照组相比，转染siEgr-1组能显著上调Bax的表达，同时上调Bcl-2，降低Bcl-2/Bax的比值，显著促进细胞凋亡。 3 讨论 细胞自噬是细胞通过溶酶体途径清除内部一些衰老、无用的细胞器或者错误合成的蛋白质的过程，在进化上高度保守。已有大量的研究证实，多种疾病的发生发展与细胞自噬的失调有关，尤其是恶性肿瘤。肿瘤细胞自噬是引起肿瘤细胞放、化疗耐受的重要原因［6-8］，因此通过调节和抑制自噬进行肿瘤的预防及治疗将成为临床肿瘤治疗的重要策略之一。 胰腺癌是一种具有高度侵袭性的恶性肿瘤，发病隐匿，大部分患者确诊时已属中晚期，预后极差，对放疗和化疗抵抗，死亡率接近100%，5年生存率低于5%。研究证实，胰腺癌的发生、发展对自噬有独特的依赖性。胰腺癌的原发肿瘤和细胞系在基础状态下呈现出较高的自噬水平，抑制自噬能延长胰腺癌小鼠模型的存活率、极大地减缓瘤体的生长。 汉防己甲素现又名粉防己碱，是从防己科植物粉防己的块根中提取的双苄基异喹啉类生物碱是粉防己的主要有效成分。有文章报道，体外运用较高浓度汉防己甲素不仅能直接抑制肿瘤生长，并且具有诱导肿瘤细胞凋亡、放疗增敏、逆转耐药等作用。但同时也有文章报道，低浓度汉防己甲素可诱导肝癌、乳腺癌、宫颈癌细胞自噬，作为一种保护机制拮抗细胞凋亡，但目前汉防己甲素对胰腺癌细胞自噬的影响未见报道。 本实验中我们采用不同浓度（1μg/mL，4μg/mL，8μg/mL，20μg/mL）的汉防己甲素处理胰腺癌细胞PaTu8988，结果证实低浓度（1μg/mL，4μg/mL，8μg/mL）汉防己甲素对细胞增殖无明显抑制作用，但可显著诱导PaTu8988自噬，且呈浓度依赖性，同时对细胞凋亡无明显影响。即刻早期基因Egr-1是具有锌指结构的转录因子，能对各种外界刺激，包括血清、缺氧、化疗药物等做出迅速的反应，启动一系列下游基因的表达，调控肿瘤细胞的生长、迁移和化疗耐受。并且我们前期的实验证实，即刻早期基因Egr-1通过调控自噬引起肝癌化疗耐受。因此，本次实验采用siRNA干扰的方法，抑制Egr-1的表达，实验结果显示，转染siRNA-Egr-148h能有效地下调PaTu8988中内源性Egr-1的表达。 不仅如此，干扰Egr-1能显著抑制低浓度的汉防己甲素（8μg/mL）所引起的自噬相关蛋白Beclin-1的表达及下调LC3II/LC3I的比例，同时上调凋亡相关蛋白Bax表达，下调Bcl-2表达，降低Bcl-2/Bax的比值。 本次实验证实，抑制即刻早期基因Egr-1可以有效拮抗汉防己甲素引起的胰腺癌细胞PaTu8988的自噬，促进细胞凋亡，提高汉防己甲素的抗肿瘤效果。目前汉防己甲素的各种抗肿瘤作用研究多局限于基础试验阶段，系统的临床研究尚未见报道。因此深入了解汉防己甲素引起细胞凋亡、自噬的机制，将为开发出特色有效的抗肿瘤药物提供一定的理论基础。 参考文献：略 |
