防己水煎液总生物碱的镇痛抗炎作用及其机制研究 王蒙、李静、魏晴、郭辰、王秋红、杨炳友、匡海学 目的：研究防己水煎液总生物碱的镇痛抗炎作用及其作用机制，为进一步明确防己水煎液中水溶性强、极性大的生物碱类成分的药理作用提供科学依据。 方法：采用732型阳离子树脂富集防己水煎液中总生物碱。通过醋酸致小鼠疼痛扭体法，热板致小鼠疼痛舔足法观察其镇痛作用。通过二甲苯致小鼠耳廓肿胀法，角叉菜胶致大鼠足趾肿胀法观察其抗炎作用。同时结合脂多糖（LPS）诱导的小鼠巨噬细胞ＲAW264.7细胞模型探讨作用机制，采用噻唑蓝比色法（MTT法）测定细胞毒性，酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞上清液中一氧化氮（NO），肿瘤坏死因子－α（TNF－α），白介素－6（IL－6）的含量，观察释放炎症因子的变化。 结果：镇痛实验中总生物碱可有效减少小鼠疼痛扭体次数（P＜0.01），可提高小鼠热痛舔足痛阈值（P＜0.01）。抗炎实验中可减小耳廓肿胀度（P＜0.01），减小足趾肿胀度（P＜0.01），提高两者抑制率。ＲAW264.7细胞模型中可降低炎症因子NO、TNF－α、IL－6的释放（P＜0.01）。 结论：防己水煎液总生物碱具有显著的镇痛抗炎作用，其机制可能与减少炎症因子释放有关。 关键词:防己水煎液;总生物碱;镇痛;抗炎;作用机制 防己为防己科植物粉防己Stephania tetrandra S.Moore的干燥根，味苦、性寒，归膀胱、肺经，有祛风止痛、利水消肿等功效。中医主要用于风湿痹痛、水肿脚气、小便不利、湿疹疮毒的治疗，其所治疗疾病多伴随疼痛、炎症等临床表现。 本文针对防己传统临床用药方式多为水煎煮，通过732型阳离子吸附树脂对防己水煎液中总生物碱类成分进行富集。采用醋酸扭体法，热板舔足法探讨其镇痛作用，采用二甲苯致耳廓肿胀法，角叉菜胶致足趾肿胀法探讨其抗炎作用，同时通过观察脂多糖（LPS）诱导下小鼠巨噬细胞ＲAW264.7细胞分泌炎症因子的影响，探讨其可能的作用机制。 本文区别于以往对防己醇提物的研究，所选用的防己水煎液总生物碱为一类水溶性强、极性大的生物碱类成分，能够更为客观准确的反映出临床水煎服用时所进入人体的化学成分，为进一步研究防己的镇痛抗炎作用及其作用机制提供科学依据。 1材料与仪器 1.1动物 SPF级ICＲ小鼠，雌雄兼备，体质量18～22g。SPF级SD大鼠，雄性，体质量180～220g。由黑龙江中医药大学安全评价中心提供，许可证号SCXK（黑）2013－0006。动物饲养于标准环境:温度（20±1）℃，相对湿度（60±5）%，明暗周期12h，标准颗粒饲料喂养。 1.2样品与制备 防己药材购自华夏药业有限责任公司，经黑龙江中医药大学药学院王振月教授鉴定为防己科植物粉防己Stephaniate trandra S.Moore的干燥根。水煎液由粉防己的干燥根加热回流提取并浓缩制备，其中总生物碱由732型阳离子吸附树脂富集水煎液中生物碱类成分后洗脱浓缩制备，以上实验用药均由黑龙江中医药大学中药化学实验室制备。 1.3试剂 阿司匹林肠溶片（利群药业有限责任公司，批号131101），地塞米松片（天津柏海药业有限责任公司，批号130904），吗啡（东北制药集团公司沈阳第一制药厂，批号080701），二甲苯（天津富宇精细化工有限公司，批号20130602），角叉菜胶（Sigma公司，批号069K0023），脂多糖（LPS，Sigma公司，批号L－2880），噻唑蓝（MTT，Amresco公司，批号0793），二甲基亚砜（DMSO，Sigma公司），胎牛血清（FBS，北京全式金生物技术有限公司），小鼠一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子－α（TNF－α）、白介素－6（IL－6）ELISA测试试剂盒（北京城林生物科技有限公司），小鼠巨噬细胞株ＲAW264.7细胞（中国科学院上海细胞库）。 1.4仪器 ACS型电子秤（上海精密科学仪器有限公司），BSA224S型电子分析天平（德国Sartorius公司），7140型爪肿测量仪（深圳瑞沃德生命科技有限公司），GJ8402型热板测痛仪（宁海白石电子医药仪器厂），超净工作台（北京东联哈尔仪器制造公司），倒置相差显微镜（德国ZeISS公司），二氧化碳培养箱（Thermo公司），酶标仪（PerkinElmer公司）。 2方法 2.1镇痛实验 2.1.1醋酸致小鼠疼痛扭体实验 ICＲ小鼠，雌雄各半，按体质量和性别随机分为5组，每组12只。设生理盐水阴性对照组（NS，20ml·kg－1），阿司匹林阳性对照组（0.02g·kg－1），防己水煎液总生物碱低（0.045 g/kg）、中（0.135g/kg）、高（0.270 g/kg）剂量组。各组灌胃给药，1次/d，连续7d。末次给药60min后ip0.6%醋酸0.2ml/只（醋酸溶液现用现配）。记录各组小鼠ip醋酸后15min内扭体反应（躯干伸张、腹部内凹、臀部抬高）次数，并计算抑制率。抑制率（%）=（阴性对照组扭体次数－给药组扭体次数）/阴性对照组扭体次数×100%。 2.1.2热板致小鼠疼痛舔足实验 ICＲ小鼠，雌性，放于预热（55±0.5）℃金属板上，记录小鼠出现舔后足反应时间（s），小于5s或大于30s或出现跳跃的均放弃使用。取筛选合格的雌性ICＲ小鼠，按体质量随机分为5组，每组12只。给药前测痛阈值2次，取平均值作为基础痛阈值。除吗啡阳性对照组（0.005g·kg－1）外，其余各组同“2.1.1”项。 各组灌胃给药，1次/d，连续7d。末次给药后60、120、180min测定小鼠痛阈值。2.2抗炎实验2.2.1二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验ICＲ小鼠，雄性，按体质量随机分为5组，每组12只。除地塞米松阳性对照组（0.01g/kg）外，其余各组同“2.1.1”项。各组灌胃给药，1次/d，连续7d。末次给药60min后小鼠左耳廓两面均匀涂抹致炎剂二甲苯，0.02mL/只，右耳不做任何处理为正常耳。60min后小鼠颈椎脱臼法处死，沿耳廓基线剪下双耳用9mm直径打孔器分别在同一部位打下圆形耳片并称质量，计算耳肿胀度和耳肿胀抑制率。 耳肿胀度=左耳片质量－右耳片质量。耳肿胀抑制率（%）=（阴性对照组肿胀度－给药组肿胀度）/阴性对照组肿胀度×100%。 2.2.2角叉菜胶致大鼠足趾肿胀实验 SD大鼠，雄性，按体质量随机分为5组，每组12只。分组同“2.2.1”项。各组灌胃给药，1次/d，连续7d。 测量造模前右足趾容积作为基础值，在给药60min后右后足趾ih1%角叉菜胶溶液0.1ml/只。分别测定致炎后60、120、240min的右后足跖容积，计算足肿胀率和足肿胀抑制率。 足肿胀率（%）=（致炎后足趾容积－致炎前足趾容积）/致炎前足趾容积×100%。足肿胀抑制率（%）=（阴性对照组肿胀度－给药组肿胀度）/阴性对照组肿胀度×100%。 2.3观察 LPS诱导下ＲAW264.7细胞释放炎症因子影响实验2.3.1实验分组与药物处理取对数期生长状态良好的细胞随即分为空白对照组，LPS模型组，防己水煎液总生物碱低、中、高剂量组，每个浓度设6个复孔。 实验样品质量精确称取，由DM-SO（终质量分数不超过0.1%）和无血清DMEM培养基进行溶解，空白对照组同样操作，经过0.22μm微孔滤膜过滤，现配现用。 2.3.2ＲAW264.7细胞毒性作用实验 将ＲAW264.7细胞按5×104个/ml稀释，96孔细胞培养板中100μl/孔进行接种。5%CO2、37℃培养12h。弃去上清，将含不同药物浓度的细胞培养液100μl/孔加入细胞培养板中，浓度分别为:20、40、80、160、320、640mg/L，空白对照组中加入无药物的细胞培养液，每组6复孔，继续孵育24h后，每孔加入5mg/mLMTT溶液0.02ml;继续孵育4h，弃去上清，每孔加入0.15ml的DMSO充分溶解，使用酶标仪在490nm处测定吸光度（A）。计算细胞存活率。 2.3.3ＲAW264.7细胞释放NO、TNF－α、IL－6的影响实验 将ＲAW264.7细胞按1×106个/mL稀释，96孔细胞培养板中100μL/孔进行接种。5%CO2、37℃培养12h。弃去上清，将含不同药物浓度的细胞培养液100μL/孔加入细胞培养板中，浓度分别为:低（80mg/L）、中（160mg/L）、高（320mg/L），空白对照组中加入无药物的细胞培养液，每组6复孔，孵育4h，加入LPS至终浓度为1 mg/L，继续孵育24h后3000r·min－1离心10min获取细胞上清液，吸取上清液－20℃保存。检测NO、TNF－α、IL－6按ELISA试剂盒说明操作。 2.4统计学分析 所有实验数据以珋x±s表示，应用SPSS17.0软件进行单因素方差分析，组均数之间比较应用ANOVA检验，以P＜0.05认为差异有统计学意义。 3结果 3.1对醋酸致小鼠疼痛扭体的影响结果 如表1所示，防己水煎液总生物碱各组给药后能显著减少醋酸致小鼠疼痛扭体反应次数，其作用与剂量呈正相关。防己水煎液总生物碱低、中、高剂量组与对照组比较均具有极显著性差异（P＜0.01），抑制率分别为21.04%、32.51%、50.55%。
3.2对热板致小鼠疼痛舔足的影响 结果如表2所示，给药前各组痛阈值与对照组相比无显著性差异，各组基础痛阈值之间无统计学意义（P＞0.05）。防己水煎液总生物碱各组给药后能显著提高痛阈值，与对照组相比防己水煎液总生物碱低、中、高剂量组在给药后60、120、180h均具有极显著性差异（P＜0.01）。
3.3对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响结果 如表3所示，防己水煎液总生物碱各组给药后能显著减小二甲苯致小鼠耳廓肿胀度，其作用与剂量呈正相关。防己水煎液总生物碱低、中、高剂量组与对照组比较均具有极显著性差异（P＜0.01），抑制率分别为31.79%、38.24%、48.34%。
3.4对角叉菜胶致大鼠足趾肿胀的影响结果 如表4所示，防己水煎液总生物碱各组给药后能显著减少角叉菜胶致大鼠足趾肿胀率，与对照组相比防己水煎液总生物碱低、中、高剂量组在给药后60、120、240min均具有极显著性差异（P＜0.01）。其在60min低、中、高剂量组抑制率分别为12.76%、26.61%、33.74%;在120min低、中、高剂量组抑制率分别为17.56%、31.39%、38.14%;在240min低、中、高剂量组抑制率分别为14.38%、26.09%、47.95%，其作用效果与剂量表现出一定的正相关性。
3.5对ＲAW264.7细胞的毒性作用结果 如表5所示，防己水煎液总生物碱浓度小于320 mg/L时均无明显的细胞毒性，实验选择320 mg/L为起始质量浓度，倍比稀释。因此选择80，160，320 mg/L作为低、中、高3个质量浓度进行实验。
3.6对ＲAW264.7细胞释放NO、TNF－α、IL－6的影响 结果如表6所示，LPS可诱导ＲAW264.7细胞释放炎症因子NO、TNF－α、IL－6的量增加，与空白对照组相比具有极显著差异（P＜0.01）;防己水煎液总生物碱可降低LPS诱导下ＲAW264.7细胞释放炎症因子NO、TNF－α、IL－6的量。防己水煎液总生物碱低、中、高剂量组与LPS组相比具有极显著差异（P＜0.01）。
4讨论 疼痛和炎症是大多数疾病常伴随出现的临床表现，因此镇痛抗炎药已成为全球处方中最常应用的一类药物。但化药的长期使用易引起多种不良反应，如胃肠道、中枢神经、心血管等系统损害;肝脏、肾脏等器官损伤。 目前以中药为代表的天然药物因其源于生物体本身，作用时常表现出多靶点综合起效具备高效低毒等特点，已成为镇痛抗炎药的研究热点。天然药物的镇痛抗炎效果主要表现为对压痛、热痛、化学刺激等多种致痛因素引发疼痛后痛阈值的延长，对化学、物理刺激引起的炎性肿胀的抑制，对炎症因子及其表达的影响，对炎症反应时腹腔毛细血管的通透性的降低等。 小鼠巨噬细胞ＲAW264.7可由LPS诱导，致炎后产生一系列的反应，引起细胞产生大量的炎症因子变化。其中NO做为一种炎症因子可引发炎症部位出现渗出和水肿。TNF－α可使黏附的中性粒细胞产生呼吸爆发，协同其他促炎细胞因子的表达使其在致病过程中相互促进。IL－6可促进B细胞活化，激活信号转导子和转录激活子，进一步加重炎症反应过程。TNF－α和IL－6是炎症反应过程中重要的炎症因子，都与转录因子NF－κB的调控相关。 本文选取中药防己为研究对象，考察其中总生物碱的镇痛抗炎效果及作用机制。考虑中医传统临床用药方式为水煎服，对药材进行水热回流提取，再经732型阳离子吸附树脂对水煎液中总生物碱进行富集。根据匡海学教授提出的"中药性味可拆分性"理论，所得部位能够准确反映出防己临床用药时所进入人体的成分，区别于以往对于醇提物的研究。 镇痛实验选取醋酸致痛扭体法和热板致痛舔足法，分别对外周镇痛和中枢镇痛进行考察，防己水煎液总生物碱各剂量组均表现出显著的镇痛作用。抗炎实验选取二甲苯致耳廓肿胀法和角叉菜胶致足趾肿胀法，对急性炎症肿胀进行考察，防己水煎液总生物碱各剂量组可显著降低耳廓、足趾肿胀度，提高相应抑制率并与剂量呈正相关。ＲAW264.7细胞模型中，防己水煎液总生物碱可有效减少LPS诱导下ＲAW264.7细胞释放NO、TNF－α、IL－6，其机制可能与抑制活化巨噬细胞释放炎症因子有关。 本文实验内容为进一步研究中药防己镇痛抗炎作用和其相关作用机制打下良好基础并提供了科学依据。 参考文献：略 |
