我汉防己甲素对系统性白念珠菌感染小鼠的治疗作用 石建萍，李水秀，朱坤举，张玲玲，张艺山，张宏 摘 要： 目的：观察汉防己甲素在系统性白念珠菌感染小鼠中抗真菌疗效、细胞免疫调节效应及两者相关性。 方法：雌性BALB/c小鼠随机分为对照组和感染组。对照组予生理盐水，感染组在尾静脉注射白念珠菌悬液后3 h，经腹腔注射不同剂量汉防己甲素(o、15、30、45和90 mg/kg)，每日一次，连续7 d。观察小鼠生存时间、肾脏载菌量以及肾脏组织病理学检查评估抗真菌疗效；同时以ELISA法检测血清和Real-time RT-PCR检测肾组织中细胞因子IFN-7、IL-10、TGF-61和IL-17A水平的动态变化。 结果：与腹腔注射生理盐水的感染小鼠比较，汉防己甲素在90 mg/kg时，肾脏载菌量减少(P<0.05)，与升高血清及,ff组织IFN-7、TGF-171水平，降低IL-10、IL-17A水平有相关性；在45 mg/kg及以下剂量时，生存时间、组织载菌量及细胞因子无差异(P>0.05)。 结论：汉防己甲素在90 mg/kg时对系统性白念珠菌感染小鼠具有治疗作用，与其细胞免疫调节有相关性。 关键词：汉防己甲素；白念珠菌；小鼠 系统性白念珠菌病成为各种重症患者和免疫功能低下患者主要感染并发症之-[1]。对白念珠菌感染发病机制的研究表明，细胞免疫在白念珠菌感染中占主导地位，是宿主抵御真菌感染的主要机制，免疫细胞发挥作用的主要方式之-是分泌细胞因子，包括各种促炎因子及抑炎因子，它们在血清和组织中含量的高低，代表着机体抵御病原生物感染的能力及免疫状况，从而造成疾病的不同发展和转归。 汉防己甲素(Tetrandrine，TET)，是从天然药用植物防己科千金藤属植物粉防己的块根中抽提出来的-种生物碱，药理作用广泛，用于抗炎、抗高血压、抗矽肺、抗纤维化、免疫调节等治疗。其在免疫调节的作用是多方面的，包括抑制T淋巴细胞、嗜中性粒细胞及单核巨噬细胞等炎症细胞的增殖和激活、抗自由基损伤、抑制炎症介质释放。 近十年，我们证实，在体外、实验动物局部外用和单纯性阴道念珠菌病志愿患者局部外用，汉防己甲素对氟康唑等唑类药物抗白念珠菌活性有显著的增效作用。但汉防己甲素对系统性白念珠菌病的体内影响，尚未明确。检索文献，未见报道。因此，在本实验中，我们以系统性白念珠菌感染小鼠为研究对象，通过腹腔注射不同剂量汉防己甲素，以小鼠生存时间、肾脏真菌载菌量以及肾脏组织病理学检查评估其抗真菌疗效；以ELISA法检测血清和Real-time RT-PCR检测肾脏中细胞因子IFN-7、IL-10、TGF—j31和IL-17A水平，评估其对各细胞因子的影响情况，初步探讨其抗真菌疗效、细胞免疫调节效应以及两者的相关性。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1实验菌株：白念珠菌标准株SC5314由william A Fonzi教授(Department of Microbiolog YandImmunology，GeorgetownUniversity，Washington DC，USA)惠赠。菌种-80℃保存。 1.1.2药物：TET，陕西慧科植物有限公司，批号20041226，纯度98％。TET粉用灭菌蒸馏水和0.1 mol/L的HCI溶解，配制成15mg/ml的储备液，根据实验要求将原液分别稀释为15、30、45和90mg/kg。 1.1.3实验动物：SPF级雌性BAI。B/c小鼠，6—8周龄，体质量17～20g，由广东省实验动物实验中心提供，批号：No.43007101008664。饲养于深圳北京大学香港科技大学医学中心[动物许可证号：SYXK(粤)2010—0106]，动物伦理委员会批准号：(2013—005)。 1.1.4试剂：ELISA试剂盒购自杭州联科生物技术有限公司；抗小鼠CD4 FITC-CD4抗体、抗小鼠TGF-β1 PE-TGF-β1抗体、抗小鼠II-17APE-IL17A抗体、抗小鼠IL-10 PE-IL10抗体、抗小鼠IFN-γPE-IFN-γ抗体、破膜剂缓冲液及布雷非德菌素购自Ebioscience USA公司；Trizol总RNA提取试剂盒购自英潍捷基(上海)贸易有限；FastQuantcDNA第-链合成试剂盒购白天根生化科技(北京)有限公司；UhraSYBR Mixture购自北京康为世纪生物科技有限公司。 1.1.5主要仪器设备：ST16R高性能通用台式冷冻离心机购自美国赛默飞世尔科技有限公司；实时荧光定量PCR仪购自ABI 7000(美国应用生物系统公司)；酶标仪型号SpectraMax M2购自美国分子仪器公司。 1.2方法 1.2.1构建系统性白念珠菌感染小鼠模型：挑取白念珠菌SC5314单克隆菌落，接种前菌株经2次SDA培养基活化(培养温度为35℃)后，挑取新培养24 h的白念珠菌菌落，采集对数生长期细胞(摇菌12-16h)，洗涤，悬浮在生理盐水中，血球计数板记数，以5×105CFU/mI。的白念珠菌悬液0.2mL尾静脉注射小鼠。 1.2.2分组及治疗：分为6组，每组23只小鼠。对照组：正常小鼠，给予生理盐水；感染组：白念珠菌悬液接种小鼠，TET0组为生理盐水；TET15组、TET30组、TET45组、TET90组分别为TET的不同剂量(15、30、45和90 mg/kg)，在接种小鼠后3 h，开始腹腔注射，每日一次，连续7 d。 1.3 TET在系统性白念珠菌感染小鼠中抗真菌疗效 1.3.1生存时间：观察各组8只小鼠，从尾静脉注射白念珠菌悬液，成功构建白念珠菌感染小鼠开始观察，包括在连续腹腔注射7 d以及停止治疗后，观察至28 d，每天观察并记录各组小鼠的死亡情况。 1.3.2肾脏载菌量测定：以肾脏菌落形成单位(CFU)表示。分别予第1 d、4 d、8 d，每组各取5只小鼠，无菌取小鼠-侧肾脏。具体步骤：①用微量电子天平称量左侧肾脏的重量；②将肾脏剪成小块装入组织匀浆器中，加入1 mI。无菌生理盐水，研磨；③移液器吸取100 FL组织匀浆加入900FI.无菌生理盐水lO倍稀释，取100“L接种于SDA平面培养基上，35℃孵育48 h；④计数培养基平面上生长的菌落数并计算出单位重量小鼠肾脏所含的菌量(1091。CFU/g)。 1.3.3病理组织活检：第8 d处死小鼠，无菌取出小鼠-侧肾脏浸人4％多聚甲醛固定，乙醇脱水，二甲苯固定透明，石蜡包埋，连续组织切片(片厚5μm)。予HE染色和PAS染色。 1.4 TET在系统性白念珠菌感染小鼠中IFN-γ、IL-10、IL-17A和TGF-β1影响 1.4.1 ELISA检测血清IFN-γ、IL-10、IL-17A和TGF-β1水平：分别予第1d、4 d、8 d，每组各取5只小鼠，内眦静脉取血至肝素抗凝管，通过双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清IFN-γ、IL-10、IL-17A和TGF-β1水平。 1.4.2 Real-time RT-PCR检测肾脏中IFN-γ、IL-10、IL-17A和TGF-β1 mRNA相对表达量Trizol提取肾脏组织总RNA，按照FastQuant cDNA第-链合成试剂盒说明书操作步骤合成cDNA，应用SYBR Green染料法，通过ABI 7000定量PCR仪检测。扩增引物合成，设计长度约15～20 bp，各种细胞因子的引物由上海生物工程有限公司合成，用ddH：0稀释至200 pmpl/μL，分装后-20℃冰箱保存。引物序列如下：以相同的cDNA扩增目的基因，分别取cDNA 1μL加入PCR八连管，依次加入UltraSYBR Mix-ture 10μL，目的基因上下游引物各0.5μL，无菌蒸馏水8μL，构成20μL反应体系，每个样品做3次重复。扩增条件：95℃预变性10 min，变性95℃10 S，退火60℃30 S，延伸72℃32 S，共40个循环。结果根据目标基因和内参基因UB得到的Ct值，采用2-△△c‘法进行样品间相对定量分析。 1.5统计学处理：使用SPSSl6.0软件进行统计学分析。计量资料以(i±s)表示。生存率采用生存分析(Kaplan-Meier)，生存率曲线以Log-rank检验进行比较；多组间均数比较采用单因素方差分析(One-wayANOV检验)，每两个均数比较采用S-N-K检验(Student-Newman-Keuls)，肾脏载菌量与血清及肾脏各细胞因子相关性采用Pearson相关性分析，P<0.05差异有统计学意义。 2结 果 2.1 TET对系统性白念珠菌感染小鼠中抗真菌疗效 2.1.1生存时间观察：对照组和TET0、TET15、TET30、TET45、TET90组中小鼠中位生存时间分别为25 d、12 d、12 d、12 d、12 d、16 d。经Log-rank检验，与TET0组生存率曲线比较，TET10、TET/15和TET30组无差异(P>0.05)；而TET90组与对照组和其他TET剂量组比较，有差异(P<0.05)，见图1。
2.1.2肾脏载菌量测定：在不同时间点，与TET0组比较，TET15、TET30和TET45组检测肾脏载菌量，无差异(P>0.05)，TET15、TET
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