外用护肤品研发中皮肤过敏试验方法研究进展 荆喜中、王晖 摘要：致敏性是外用护肤品研发中考察的毒性试验项目之一，传统皮肤过敏试验是根据动物皮肤重复接触受试品后的反应，对受试品的致敏性进行评价，但存在动物用量大、检测结果主观性强等问题。近年来，皮肤过敏试验开始采用细胞培养、重组皮肤、计算机专家系统等替代模型，动物应用减少，科学性和人道性得到提升。本文比较系统地介绍了各种皮肤过敏试验方法、存在问题及发展前景，为外用护肤品研发提供借鉴。 关键词：外用护肤品、皮肤过敏、试验方法、替代试验 皮肤过敏是一种由免疫介导的皮肤变态反应。皮肤作为人体免疫系统的第一道防线，直接与环境接触，较其他器官更容易过敏，据报道全球有15%～20%的人群发生过皮肤过敏，常见的皮肤过敏现象有瘙痒、风团、红斑、紫癜、丘疹等。如今人们使用的外用护肤品种类日益繁多，皮肤过敏的发生率呈上升趋势。 护肤品的成分复杂，含多种化学物质，如香料、色素、乳化剂、防腐剂、起营养和治疗作用的添加剂等，其中很多成分可刺激皮肤并引发过敏。在外用护肤品研发中需对产品进行皮肤致敏性检验，本文综述了以下几种实验室皮肤过敏试验方法，并比较了他们的优缺点及发展趋势。 1被动皮肤过敏试验（passivecutane-ousanaphylaxis，PCA） PCA多采用大鼠完成，包括致敏、被动皮肤致敏和激发三个过程，以卵白蛋白或天花粉致敏大鼠，采血得致敏血清，另取大鼠在背部皮下注入致敏血清，48h后进行受试品抗原激发，尾静脉注射同种抗原和伊文思蓝，测量背部蓝斑大小，直径＞ 张宏等采用ELISA法定量检测被动致敏大鼠激发后血清中IgE和组胺水平，全自动血细胞分析仪检测嗜酸性粒细胞，减少了蓝斑测量引起的误差。PCA缺点是使用动物量大，周期长，检测方法主观性强，因此已较少应用，可作为其他皮肤过敏试验方法的对照模型。 2豚鼠最大化试验（guineapigmaximi-zationtest，GPMT）和豚鼠封闭斑贴试验（buehlerpatchtest，BT） 豚鼠试验选取豚鼠20～30只，皮肤涂抹（BT）或颈背部皮下注射（GPMT）受试品使其致敏，致敏剂量应足够高，以产生轻中度皮肤刺激且能全身耐受为度，经6～8d局部诱导，第20～22天给予激发剂量，用含受试品的封闭片对豚鼠背部贴敷，去除贴片后，观察皮肤红斑、水肿、结痂等情况给予评分，若最终难以确定致敏性可在1周后再次激发。 BT试验抗原刺激强度弱于GMPT，敏感性稍低，对致敏性稍弱的受试品可能产生假阴性结果。TakeyoshiM等认为GMPT虽对受试品敏感度高，但缺少定量致敏效应的评价标准。总体而言，豚鼠试验敏感性高，但由于受试动物剂量远高于人实际的应用剂量、强烈致敏造成动物较大痛苦、受试品颜色易对试验产生干扰、周期长及不够经济等原因，豚鼠试验已慢慢被各种改良的方法所取代。 3小鼠耳肿胀试验（mouseearswellingtest，MEST）和非侵入性小鼠耳肿胀试验（noninvasivemouseearswellingas-say，MESA） 小鼠试验是上世纪八十年代开发的豚鼠试验的替代方法，选用6～8周龄健康小鼠，MEST对小鼠皮内注射完全弗氏佐剂，用胶带剥离腹部皮肤角质层，涂抹受试品，连续致敏3d，第10天给小鼠左耳涂受试品激发，右耳涂溶剂作对照，以耳厚为指标评估受试品致敏性。 一般以实验组耳厚超过对照组20%为致敏阳性。MESA在小鼠腹部涂抹受试品，5d后耳部涂抹激发，在24，48，72h测量耳廓肿胀程度。MESA是迟发型超敏反应模型，与MEST相比，无注射佐剂、麻醉、破坏角质层屏障等操作，用于检测接触性皮炎的致敏原，可检测出弱致敏物和芳香物质中的致敏成分。饲喂富含VitA的饲料可数倍提高小鼠试验抗原免疫敏感性。小鼠试验成本低，周期短，操作简便，易于测量，还可作为抑制炎症的抗炎药物筛选模型。 4局部淋巴结试验（locallymphnodeassay，LLNA） LLNA原理是致敏物作用于小鼠耳背后引起耳局部引流淋巴结内T淋巴细胞活化增殖，增殖量与受试品致敏性成正比。将含受试品溶液涂抹小鼠耳背3d，第5天将放射性3H标记的受试物注入小鼠尾静脉激发，剔除耳部引流淋巴结，制备单细胞悬液，使用流式细胞仪计数受试品引起的T细胞增殖量，并计算与赋形剂组增殖量的比率（即刺激指数SI），若SI≥3认为受试品致敏阳性。 LL-NA使用小鼠替代相对昂贵的豚鼠，试验只需1周，每组4只动物即可，大幅缩短试验周期，减少动物数量和痛苦，结果判断由定性观察改进为定量检测，且不受受试品颜色干扰，遵循3Ｒ（Ｒeplace，Ｒe-duce，Ｒefine）原则，自开发以来被广泛应用，但LLNA不如豚鼠试验灵敏，可出现假阴性结果，同时还有放射性污染的缺点。 常用的LLNA的改良方法有局部淋巴结-三磷酸腺苷检测法（LLNA-DA）和局部淋巴结-溴脱氧嘧啶核苷-酶联免疫吸附法（LLNA-BrdU-ELISA）。LLNA-DA法根据T细胞增殖后ATP含量增加，用ATP荧光强度反映细胞的增殖情况，制备淋巴结悬液后，振摇使T细胞内ATP释放，加入荧光-荧光素酶，检测ATP发光值。操作简便、灵敏度高，因ATP不稳定，要控制好检测时间。 LLNA-BrdU-ELISA法对致敏小鼠腹腔注射溴脱氧嘧啶核苷（BrdU）标记液替代3H作示踪剂，BrdU抗体可结合淋巴结细胞，ELISA法检测BrdU加入量，避免放射性污染，同时提高检测灵敏度。 5体外细胞试验（cellcultureassayiInvitro） 动物皮肤过敏试验存在判断主观性强，不够人道等问题，2009年欧盟禁止使用动物试验进行化妆品急性毒性和过敏性评价，2013年全面禁止化妆品及原料的动物安全测试，并禁止从外国进口销售违禁化妆品，因此体外替代试验将是护肤品皮肤致敏性检验的发展趋势。 随着国际上3Ｒ理论的推广，现已建立多种细胞替代试验。选择合适的细胞类型是体外细胞试验的关键，细胞模型应尽可能模仿皮肤免疫功能，且应易得、稳定、可重复。一般选取角质形成细胞培养系统、树突细胞培养系统为培养模型。 5.1角质细胞系试验 角质形成细胞占皮肤角质层90%以上，外源性抗原首先与角质细胞接触才能触发皮肤免疫，其分泌的IL-8，IL-18等，对表皮朗格汉斯细胞的激活发挥了重要作用。角质细胞系试验可选用人角质形成细胞株NCTC2544或HaCaT，不同浓度的受试品与角质细胞孵育24h，ELISA法检测胞内IL-18表达量。角质细胞系试验不能区别受试品为致敏物还是刺激物，如果可确定为致敏物，还可评估受试品的致敏潜力。 5.2树突细胞系试验 朗格汉斯细胞是皮肤最主要的抗原提呈细胞，当它受到抗原刺激迁移至局部回流淋巴结，可引起淋巴结内T细胞分化增殖，触发免疫反应，但朗格汉斯细胞只占表皮细胞总数的1%～3%，不仅分离纯化困难，在培养准备阶段朗格汉斯细胞还可自动分化成熟，影响试验准确性，因此树突细胞系试验需选取其他的替代品。 人树突细胞系活化试验（h-CLAT）选取人急性单核细胞白血病细胞株THP-1，与受试品共培养24h后，检测细胞表面CD56和CD84的表达量。h-CLAT法重复性好，结果与LLNA一致率达到82%，与人体反应一致率达到83%，已被欧洲实验方法替代中心（ECVAM）收录，其缺点是对水溶性低的受试品可能得出假阴性结果。 树突细胞迁移试验（DCMigrationAssays）采用髓系白血病细胞系MUTZ-3，根据朗格汉斯细胞迁移原理，采用双室系统，将MUTZ-3细胞置于上层，重组趋化因子CXCL12或CXCL5位于下层，受试品与MUTZ-3细胞接触，被致敏物诱导的MUTZ-3细胞向CXCL12迁移，而暴露于非致敏物的MUTZ-3细胞向CX-CL5迁移。此方法准确率高，在不同的实验室结果变化小，但可检测化学品有限，其系统复杂性限制了其广泛应用。 5.3角质形成细胞-树突细胞松配式共培养检测法 角质形成细胞-树突细胞松配式共培养检测法使用单核细胞诱导的树突细胞与角质细胞松配式共培养，与受试品作用后，用流式细胞仪检测树突细胞表面CD86表达量，此模型较单一细胞模型接近体内过敏发生情形，灵敏性和重复性提高。 6重组皮肤组织模型（reconstructedskintissuemodel） 因伦理学限制、存储条件及存活时间等因素制约，人的离体皮肤来源有限，因此构建重组离体皮肤组织用于外用护肤品致敏性筛查具有巨大应用前景。三维重组皮肤将角质细胞和树突细胞等镶嵌到成纤维细胞、胶原蛋白等混合的组织工程骨架上构成组织工程皮肤模型，目前已有EpiskinTM、EpiDermTM、SkinEth-icTM等几种重组皮肤替代模型被ECVAM认可。 根据与受试品接触后，重组皮肤模型细胞活性及细胞因子IL-1α，IL-18的含量变化评价致敏性，但目前的重组皮肤模型多应用于刺激性的评价。 7体外多肽反应（dieectpeptidereacvi-tyassay，DPＲA） 体外多肽反应根据大多数化学致敏原是亲电子的，可透过表皮与体内的氨基酸亲核中心共价结合，转化为全抗原，从而诱发过敏反应。试验时受试品与合成的多肽模型共孵育，致敏性强的受试品消耗肽段多，根据受试品多肽消耗量评价其致敏性。 Gerberick等通过检测82个化合物与谷胱甘肽、半光氨酸和赖氨酸缩合的肽段共孵育，结果与LLNA试验一致率达89%。体外多肽反应得到ECVAM许可用于受试品致敏性的前期筛查。8定量结构活性关系模型（QSAＲ）致敏物的致敏效力与其化学结构密切相关，因此采用QSAＲ模型可以初步对受试品进行致敏性筛查。 现在常用的QSAＲ模型包括计算机专家系统DE-ＲEK、TOPKAT、TIMES-SS等DEＲEK系统重点考察化学物与体内受体蛋白的结合能力，通过人机对话方式，检测受试品与受体蛋白的反应能力，如触发结构警示，再检验其皮肤渗透系数预测受试品穿透皮肤的能力，如两次均为阳性，则认为受试品为潜在致敏原。 TOPKAT系统通过一组已知的化合物结构和致敏性的相关数据，建立结构碎片、结构参数与致敏性之间的数学关系式，用于评价已知结构的化合物的致敏性。TIMES-SS系统模拟不同结构化合物在皮肤的代谢转化及其与皮肤内蛋白的相互作用，随着数据库的丰富和完善，TIMES-SS系统被欧洲化学品联盟和经济合作组织（OECD）所采纳。 9小结与展望 皮肤过敏试验是外用护肤品研发中安全性评价的重要内容，尽管现在已开发出多种方法，但都无法达到100%的准确率，因此制定实验方案时需清楚每种方法的适用情况和局限性。 为全面准确得出护肤品的致敏性，可首先对其成分进行信息检索，结合QSAＲ模型分析，再使用体外皮肤渗透试验和多肽结合试验检验其进入体内转化成抗原的可能，优先选择体外替代试验，如需进行动物试验优先使用LLNA法。 体外替代试验已成为研究皮肤过敏的热点，它不仅可以体现人道主义，提高动物福利，在促进科技进步，发展经济，打破发达国家贸易壁垒等方面都有重要意义。 尽管替代法在受试品致敏性筛查中还有一些难题没有攻破，但相信体外替代试验在外用护肤品研发中会得到越来越广泛的应用。 参考文献：略 |
